本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛脂肪組織中馬波沙星殘留量檢測(cè)的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛脂肪組織中馬波沙星殘留的定性和定量測(cè)定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T 6379 測(cè)試方法的精密度 通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性
GB/T 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法
3 制樣
3.1 樣品的制備
取新鮮或解凍的空白或供試動(dòng)物組織，剪碎，并使均質(zhì)。
3.2 樣品的保存
-20℃以下保存。
4 測(cè)定方法
4.1 方法提要或原理
牛脂肪中殘留的馬波沙星用5%三氯乙酸溶液（TCA）和含1%乙酸的乙腈溶液提取（V/V=8∶2），正己烷除脂，以馬波沙星-D8為內(nèi)標(biāo)，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。
4.2 試劑和材料
以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭?；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
4.2.1 馬波沙星對(duì)照品：含量≥98.0%。
4.2.2 馬波沙星-D8對(duì)照品：含量≥98%。
4.2.3 甲醇：色譜純。
4.2.4 甲酸銨：色譜純。
4.2.5 甲酸：色譜純。
4.2.6 乙酸。
4.2.7 三氯乙酸（TCA）。
4.2.8 二甲基亞砜。
4.2.9 正己烷。
4.2.10 1mol/L甲酸銨溶液
稱取3.15g甲酸銨，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。
4.2.11 5%三氯乙酸（TCA）
稱取50.0g三氯乙酸，置1000ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。
4.2.12 含1%乙酸的乙腈溶液
量取500ml乙腈和10ml乙酸，置1000ml容量瓶中，混勻，用乙腈稀釋至刻度。
4.2.13 馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000μg/ml）
取馬波沙星對(duì)照品約10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，配制成為濃度為1000μg/ml的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。－18 ℃以下保存，有效期6個(gè)月。
4.2.14 馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100μg/ml）
取馬波沙星-D8對(duì)照品0.5mg，精密稱定，置5ml容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100μg /ml的馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。－18 ℃以下保存，有效期6個(gè)月。
4.2.15 馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液（2μg/ml）
精密量取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋成濃度為2μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
4.2.16 馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)工作液（1.2μg/ml）
精密量取馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋成濃度為1.2μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
4.3 儀器和設(shè)備
4.3.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。
4.3.2 分析天平：感量0.00001g；感量0.0001g。
4.3.3 天平：感量0.01g。
4.3.4 勻漿機(jī)。
4.3.5 離心機(jī)。
4.3.6 渦旋混合器。
4.3.7 離心管：50ml。
4.3.8 試管：10ml。
4.3.9 棕色容量瓶：5ml，50ml，100 ml。
4.3.10濾膜：0.22μm。
4.4 測(cè)定步驟
4.4.1試樣的制備
取新鮮或冷凍空白或供試組織，剪碎，并使均質(zhì)。
——取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣。
——取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣。
——取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試樣。
4.4.2試樣保存
－20℃以下保存。
4.4.3 提取
稱取試樣（2 ± 0.01）g，置50 ml離心管中，添加1.2μg/ml馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)工作液適量，加5%TCA溶液和含1%乙酸的乙腈溶液（V/V=8∶2）5ml，振蕩5min， 10000r/min 離心10min，取上清液1.5ml于10ml試管中，加正己烷2ml，渦旋1min，靜置5min，取下層清液1ml，濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定。
4.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取2μg/ml馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.2μg/ml馬波沙星-D8內(nèi)標(biāo)工作液適量，用空白脂肪提取液稀釋，配制成馬波沙星-D8濃度均為120ng/ml以及馬波沙星濃度為6、10、20、80、160、200、340和400ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定。以馬波沙星特征離子質(zhì)量色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，以馬波沙星濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
4.4.5 測(cè)定
4.4.5.1 液相色譜條件
色譜柱：C18 柱 （2.0 mm×150 mm，粒徑5μm）， 或效能相當(dāng)者；
流動(dòng)相：流動(dòng)相A為1000ml水+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸銨溶液；流動(dòng)相B為1000ml甲醇+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸銨溶液，梯度洗脫條件參見(jiàn)表2；
流速：0.25 ml/min；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：5μl。
離子源：電噴霧離子源；
掃描方式：正離子掃描；
檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；
氣體溫度：350℃；
輔助氣：N2；
輔助氣流速：9.0L/min。
目標(biāo)化合物定性、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量見(jiàn)表3。
4.4.5.3.1 定性測(cè)定
通過(guò)試樣色譜圖的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間、各色譜峰的特征離子與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各色譜峰的特征離子相對(duì)照定性。試樣與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的相對(duì)偏差不大于5%；試樣特征離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)表4的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應(yīng)的被測(cè)物。
取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，做單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中的馬波沙星響應(yīng)值均在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。在上述色譜-質(zhì)譜條件下，馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白添加試樣溶液中特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄A。
4.4.6 空白實(shí)驗(yàn)
除不加試樣外，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。
4.5 結(jié)果計(jì)算和表述
4.5.1 單點(diǎn)校正法
X為試樣中馬波沙星的殘留量（μg/kg）；
A為試樣溶液中馬波沙星峰面積；
As為標(biāo)準(zhǔn)溶液中馬波沙星峰面積；
A1內(nèi)為試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物峰面積；
A2內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物峰面積；
Cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中馬波沙星濃度（ng/ml）；
V為試樣最終定容體積（ml）；
m為試樣的質(zhì)量（g）。
注：計(jì)算結(jié)果需要扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。
4.5.2 多點(diǎn)校正法
X為試樣中馬波沙星的殘留量（μg/kg）；
C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中馬波沙星的濃度（ng/ml）；
V為試樣最終定容體積（ml）；
m為試樣質(zhì)量（g）。
注：計(jì)算結(jié)果需要扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。
5 方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度
5.1 靈敏度
本方法檢出限為7.5μg/kg，定量限為25μg/kg。
5.2 準(zhǔn)確度
本方法在25μg/kg～100 μg/kg添加濃度水平上的回收率為80%～120%。
5.3 精密度
本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。
