奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最常見的一種乳腺疾病，發(fā)病率高，危害嚴重，是造成奶牛業(yè)經濟損失的四大疾病之一。奶牛乳房炎的病因很多，但與養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物的侵入有直接的關系， 研究發(fā)現，奶牛乳腺炎主要是由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌等條件性致病菌引起的。此外氣候變更、外力及遺傳因素等都對乳房炎的誘發(fā)有一定的影響，如寒冷陰濕的季節(jié)發(fā)生率較高。
本研究對2016年5月本地區(qū)某規(guī)?；伤固鼓膛龅幕既榉垦椎哪膛＝浿委熀笕晕慈牟±孽r奶樣品中的病原菌進行了分離和鑒定，以期了解頑固性病牛的病原菌感染情況，為尋找有效的治療及控制奶牛乳房炎的方法提供科學依據。
1 材料與方法
（1）材料。采自當地某奶牛場患乳房炎、有臨床癥狀且已經局部和全身用藥但體溫仍偏高、泌乳量明顯少的泌乳奶牛，同時收集健康乳區(qū)乳樣進行對照。
（2）主要試劑與儀器。麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基（包括7.5%甘露醇NaCl瓊脂、S.S.瓊脂、伊紅美蘭瓊脂等）、PCRMix、16S通用引物、生化反應管、電熱恒溫培養(yǎng)箱、DYY-6C型電泳儀、PCR儀及凝膠成像儀等。
（3）乳樣的采集及處理。采集乳樣前應先將乳區(qū)及操作人員手部徹底消毒后，棄去前面流出的乳汁，然后在無菌乳區(qū)采集50mL左右的鮮乳置于無菌的離心管中并做好標記，低溫保存并快速送至實驗室進行相關試驗。
（4）乳樣細菌培養(yǎng)。無菌環(huán)境下將病牛和健康牛的乳樣分別涂在麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上后，將各培養(yǎng)基置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時， 觀察各培養(yǎng)基表面細菌的生長情況。
（5）菌落PCR鑒定及生化反應試驗。將含有4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落溶解于無菌的生理鹽水中，煮沸10分鐘后，應用16S通用引物進行PCR擴增，PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳。鑒定結果顯示，擴增的目的片段與預期的大小一致。將其送到上海生工測序，將測序結果與在NCBI上公布的序列進行比對。將測序比對結果為葡萄球菌的片段接種于各生化反應發(fā)酵管，培養(yǎng)24小時后觀察結果。
2 細菌分離培養(yǎng)結果
兩份乳樣在麥康凱培養(yǎng)基上均可見有磚紅色、圓形凸起的菌落，由此可見乳樣中均含有大腸桿菌。含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落經16S PCR鑒定、序列比對及葡萄球菌生化反應試驗，顯示兩份乳樣中共分離出2種細菌，其中葡
萄球菌屬細菌共有5株，以金黃色葡萄球菌為最多。
3 小結與討論
本次試驗因病料采集數量有限，故分離出的細菌種類及數量均不是很多，同時當前仍有很多細菌不能通過細菌培養(yǎng)的方式獲得。為全面獲得致病菌信息，在牛乳房炎的診治過程中，可考慮應用多重PCR及高通量測序進行鑒別。通常健康牛乳和患病牛分泌的乳汁中細菌種類很多，但最常見的乳房炎致病菌是大腸桿菌、乳房鏈球菌和克雷伯氏菌等，其次是停乳鏈球菌、化膿桿菌和金黃色葡萄球菌等。研究發(fā)現，在健康或亞臨床乳樣中乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等細菌含量應低于臨床型乳房炎，且健康乳樣中應不含有大腸桿菌。但本次試驗在健康牛乳對照中也分離到了大腸桿菌，而乳房炎常見的病原菌如鏈球菌等均沒有分離到，分析原因可能是由于單純從臨床癥狀來判定是否患有乳房炎而導致，缺乏SCC等方法對隱性乳房炎的排除。
在實際生產中應堅持以預防為主、早發(fā)現早治療的原則來預防控制乳房炎。奶牛乳房炎按臨床表現可分為急性型奶牛乳房炎、慢性型奶牛乳房炎和隱性奶牛乳房炎三種，及時治療是遏制急性型乳房炎和慢性型乳房炎發(fā)展的關鍵措施，而對隱性乳房炎應重點加強控制和預防。調查發(fā)現，在各大養(yǎng)牛場中隱性乳腺炎普遍存在，其發(fā)病率可高達60%，對隱性病例如不及時診治，則易轉變成臨床型乳腺炎，帶來巨大的經濟損失。奶牛乳房炎絕大多數都是因為乳區(qū)感染致病細菌而導致，因此對奶牛乳房炎的防控應從飼養(yǎng)環(huán)境、病原菌來源等基本環(huán)節(jié)入手進行人工干預。對于微生物感染引發(fā)的乳腺炎在診治時應有針對性地選擇藥物和投藥方法，有條件的養(yǎng)殖場最好首先進行藥敏試驗來篩選最佳藥物進行有效治療。奶牛發(fā)生乳腺炎會直接影響乳汁品質，人類飲用后也會影響健康，對公共衛(wèi)生造成一定的威脅。應及時淘汰慢性或久治不愈的奶牛，防止病原微生物擴散，消除傳染源。養(yǎng)牛場應定期進行全場牛的乳房炎檢測及建立健全科學的疫病防御體系及檢疫制度，以便及時了解該病的流行情況，降低乳房炎的發(fā)病率。
（羅銘花 青海省湟源縣畜牧獸醫(yī)站）
